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中國科學(xué)院老科學(xué)家科普演講團(tuán)副團(tuán)長；中國科學(xué)院微生物研究所研究員，博士生導(dǎo)師，中國科學(xué)院研究生院教授；中國生物工程學(xué)會繼續(xù)教育工作委員會主任、工業(yè)與與環(huán)境委員會委員，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會工業(yè)生化委員會委員，中國微生物學(xué)會酶與酶工程委員會委員。主要從事酶學(xué)、酶工程、基因工程和生化工程研究。
糖尿病與胰島素的故事（五）
孫萬儒
2018年11月02日
13.桑格的貢獻(xiàn)
弗雷德里克 桑格（Frederick Sanger，1918-2013）出生于英國格洛斯特郡，從布萊恩斯滕高中（Bryanston School）畢業(yè)后，進(jìn)入了劍橋大學(xué)圣約翰學(xué)院，1939年完成自然科學(xué)學(xué)士學(xué)位。父親是一名醫(yī)生，因受父親的影響，他原本打算研究醫(yī)學(xué)，因在劍橋，受到當(dāng)時的生物化學(xué)先驅(qū)們的影響，轉(zhuǎn)而對生物化學(xué)感興趣，1943年獲得哲學(xué)博士學(xué)位，之后留校跟隨正在研究胰島素的生物化學(xué)系新任教授阿爾伯特 查爾斯 奇布諾爾開始了博士后研究，專注于氨基酸排序的工作。
桑格因建立了蛋白質(zhì)的氨基酸序列測定方法，確定了牛胰島素的氨基酸序列，同時證明蛋白質(zhì)具有明確構(gòu)造，獲得1958年諾貝爾化學(xué)獎；他還建立了快速測定DNA序列的雙去氧終止法（桑格法），于1980年再度獲得諾貝爾化學(xué)獎。在科學(xué)史上，桑格成為繼瑪麗亞 居里、萊納斯 鮑林、約翰 巴丁之后，第四位兩度獲頒諾貝爾獎，且是迄今為止唯一兩次獲得化學(xué)獎的科學(xué)家。他被認(rèn)為是20世紀(jì)世界最偉大的科學(xué)家之一。
桑格和助手塔丕從 1945年開始，就在一間半地下實驗室開始了人們不看好的蛋白質(zhì)氨基酸序列測定的研究，花了10年功夫，在1955年完成了胰島素完整的氨基酸序列測定。在桑格涉足胰島素研究之時，世界生物學(xué)界對于蛋白質(zhì)的認(rèn)知存在較大分歧，一種觀點認(rèn)為，蛋白質(zhì)沒有明確的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)；而另一派則堅持認(rèn)為蛋白質(zhì)具有結(jié)構(gòu)，并且可以通過化學(xué)方法測定氨基酸的排列順序。桑格選擇了分子中只有51個氨基酸的牛胰島素作為樣本，開始了他的研究。
他利用自己發(fā)明的桑格試劑，也就是2,4-二硝基氟苯與胰島素反應(yīng)，使得2.4-二硝基苯基牢固的結(jié)合在胰島素蛋白鏈N-端的氨基上，然后用鹽酸將胰島素徹底水解，進(jìn)行紙層析，根據(jù)不同氨基酸在展開劑中的溶解度和分配系數(shù)的不同分離成一系列斑點，然后再與層析展開的垂直方向進(jìn)行電泳，發(fā)現(xiàn)有兩個黃色氨基酸斑點，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和2,4-二硝基氟苯反應(yīng)產(chǎn)物對比，可以確定它們分別是甘氨酸和苯丙氨酸，這證明胰島素由兩條蛋白鏈組成，每個蛋白鏈的N-端氨基酸分別是甘氨酸和苯丙氨酸。然后分別對兩個蛋白鏈進(jìn)行有限水解，形成大小不同的短的片段，與2,4-二硝基氟苯進(jìn)行反應(yīng)，然后電泳分離和徹底水解，進(jìn)行層析-電泳，確定每個小片段的N-末端氨基酸。掌握蛋白鏈的不同水解條件，將其降解成不同的小片段，再進(jìn)行N-端氨基酸測定，如此可以確定每個片段的氨基酸排列順序。之后，根據(jù)不同片段和交叉片段的氨基酸排列順序，推導(dǎo)出完整的胰島素的氨基酸排列順序。
桑格的研究證明牛胰島素由A、B兩個肽鏈組成,A鏈有21個氨基酸11種，B鏈有30個氨基酸15種，共26種51個氨基酸組成。其中A鏈第7位的半胱氨酸與B鏈第7位的半胱氨酸、A鏈第20位的半胱氨酸與B鏈的第19位半胱氨酸的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來；此外A鏈中第6位半胱氨酸與A鏈第11位半胱氨酸的巰基之間也存在一個二硫鍵。
這是一個十分費(fèi)力的研究工作，而且很多時候根本得不到準(zhǔn)確的結(jié)果。對于這個并不被世人看好的研究，桑格在那間和別人共用的實驗室里，就挨著關(guān)著小白鼠的籠子旁邊，桑格堅持了10年。桑格還因為使用一種標(biāo)記氨基酸的化學(xué)試劑，影響到共用實驗室的其他人，而遭到投訴，不得不停止使用。
事后回憶這項研究，桑格也覺得“非常艱苦”。但桑格還是覺得這是他“工作過的最美妙的地方”。實驗室對他來說，始終難以割舍。
隨著生物化學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展及高新技術(shù)在生命科學(xué)研究的應(yīng)用，蛋白質(zhì)序列測定技術(shù)發(fā)展非常迅速。開始時手工測定，這種方法既費(fèi)時又浪費(fèi)樣品；1967年研制出蛋白質(zhì)測序儀，從此開始了使用儀器測定蛋白質(zhì)序列的新時代，使得蛋白質(zhì)測序有了迅速發(fā)展。不僅減少了測定周期和樣品使用量，提高了分析精度和準(zhǔn)確性，現(xiàn)在已經(jīng)成為廣泛使用的超微測序技術(shù)。現(xiàn)在一個蛋白質(zhì)樣品只需幾個到十幾個小時，幾微克，甚至幾納克就可以完成。
桑格的DNA雙去氧終止法測序是基于PCR技術(shù)，在核酸模板、核酸聚合酶、引物和四種單脫氧堿基存在條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時，如果在四個試管的反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例加入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長，而鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長。如此每管反應(yīng)體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分四個泳道進(jìn)行電泳，以分離僅差一個堿基的長短不一的核酸片段，根據(jù)片段3’端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。
1983年的一天，桑格在專心做實驗時突然感到自己已經(jīng)老了，于是停下了實驗并宣布自己退休，從此在自己的花園里度過了大部分余生。
桑格及是堅忍不拔的科學(xué)研究斗士，又是個淡泊名利名利的人。桑格和其他科學(xué)家一樣，在科研道路上也并非一帆風(fēng)順。面對失敗，他也有自己的一番感悟和應(yīng)對之道：“我想在大多數(shù)人的研究道路上，都會經(jīng)歷一些失敗的時期。這會讓人覺得郁悶，甚至絕望。對此我找到了最好的解決辦法，就是繼續(xù)向前看。當(dāng)一個實驗完全失敗時，最好不要花太多時間再去擔(dān)心它或者懊惱，而應(yīng)該繼續(xù)規(guī)劃和投入下一個實驗當(dāng)中。新的實驗總會令人興奮，這樣你很快就會忘卻煩惱。”
1986年，桑格獲得英國最高榮譽(yù)“功績勛章”，但拒絕封爵，因為他不喜歡別人稱自己為“爵士”，桑格就是這樣的人。盡管桑格在生物化學(xué)領(lǐng)域成就顯赫，被認(rèn)為是蛋白質(zhì)分子生物學(xué)和基因?qū)W領(lǐng)域的奠基人，但他并未真的蜚聲學(xué)術(shù)界之外，而這也是桑格為人低調(diào)謙遜所致。有報道稱，桑格謙虛到幾乎有點令人難以理解，他稱自己只不過是一個“愛在實驗室胡鬧”的人。還有同事形容桑格實在太低調(diào)了，以至于他被人當(dāng)作實驗室里的清潔工人。所以桑格拒絕接受“爵士”名號也就不以為奇了。
1923年麥克勞德和班廷將胰島素的專利交于多倫多大學(xué)，很快美國禮來公司獲得生產(chǎn)權(quán)，并于當(dāng)年開始大量生產(chǎn)供應(yīng)臨床應(yīng)用。同樣在歐洲丹麥諾和諾德生物制藥公司的胰島素也很快上市。胰島素使用至今，雖然不能治愈糖尿病，但卻持續(xù)不斷地挽救著無數(shù)人的生命。
時至今日，糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心腦血管疾病之后的第三大殺手，被醫(yī)學(xué)界稱為“萬病之源”，嚴(yán)重威脅著人類的健康。作為糖尿病治療中不可或缺的重點藥物，胰島素自20世紀(jì)60年代開始在我國使用至今，其臨床治療和市場均已逐漸走向成熟。胰島素是最有效的糖尿病治療藥物之一，胰島素制劑在全球糖尿病藥物中的使用量位居第一。對于 型糖尿病患者，胰島素是唯一治療藥物，此外，約有30-40%的 型糖尿病患者最終也需要使用胰島素。
而最初上市臨床使用的胰島素幾乎都是從豬或牛胰臟中提取的。不同動物的胰島素組成均有所差異，豬胰島素與人胰島素的差別很小，只是在B鏈末端差了一個氨基酸，豬胰島素是丙氨酸，而人的胰島素是蘇氨酸。牛胰島素與人胰島素相差三個氨基酸，除了B鏈末端，在A鏈中還相差兩個氨基酸。
豬或牛胰島素都不是人體的蛋白質(zhì)，長期使用會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，在人體內(nèi)會產(chǎn)生抗體，與胰島素結(jié)合形成抗體-抗原復(fù)合物，造成胰島素治療效果下降，少數(shù)患者免疫反應(yīng)較嚴(yán)重，可出現(xiàn)皮疹、發(fā)燒，全身發(fā)癢，甚至血壓下降、休克等問題。
在胰島素的化學(xué)結(jié)構(gòu)上，豬胰島素比牛胰島素更接近人胰島素，在相對的治療效果和副反應(yīng)上豬胰島素也比牛胰島素好些，所以我國在臨床上用于糖尿病治療的主要是豬胰島素。但是長期使用就會出現(xiàn)免疫反應(yīng)、療效下降的問題。
15.豬胰島素的改造
為了解決這些問題，上個世紀(jì)70年代初,美國加利福尼亞大學(xué)的生物化學(xué)家盧登堡利用化學(xué)方法成功地將豬胰島素改造成為人胰島素。這一方法一共有五步，首先用胰蛋白酶將豬胰島素分子中的B鏈上最后8個氨基酸脫去，然后在脫去這些氨基酸的部位,再連接上人工合成的相當(dāng)于人胰島素B鏈最后8個氮基酸的化合物，這樣就可以得到在分子結(jié)構(gòu)上與人胰島素一樣的胰島素。這個方法最初因生產(chǎn)成本過高，無法應(yīng)用，后來經(jīng)改進(jìn),可以在一個反應(yīng)器中進(jìn)行生產(chǎn),成本降低至僅為豬胰島素的2-3倍，將豬胰島素改造成為人胰島素才已獲成功。
后來，人們發(fā)現(xiàn)在pH為6-7的有機(jī)相中使用胰蛋白酶催化，在過量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，可以將豬胰島素B鏈C末端的丙氨酸替換下來，形成的人胰島素叔丁酯再用三氯乙酸脫去叔丁酯基團(tuán)，最終獲得人胰島素，該過程的總轉(zhuǎn)化率為60%。這種方法使得豬胰島素改造成為人胰島素更加簡便，生產(chǎn)成本更加低廉，使得豬胰島素改造成人胰島素在臨床上治療糖尿病成為現(xiàn)實。
弗雷德里克 桑格（Frederick Sanger，1918-2013）出生于英國格洛斯特郡，從布萊恩斯滕高中（Bryanston School）畢業(yè)后，進(jìn)入了劍橋大學(xué)圣約翰學(xué)院，1939年完成自然科學(xué)學(xué)士學(xué)位。父親是一名醫(yī)生，因受父親的影響，他原本打算研究醫(yī)學(xué)，因在劍橋，受到當(dāng)時的生物化學(xué)先驅(qū)們的影響，轉(zhuǎn)而對生物化學(xué)感興趣，1943年獲得哲學(xué)博士學(xué)位，之后留校跟隨正在研究胰島素的生物化學(xué)系新任教授阿爾伯特 查爾斯 奇布諾爾開始了博士后研究，專注于氨基酸排序的工作。
桑格因建立了蛋白質(zhì)的氨基酸序列測定方法，確定了牛胰島素的氨基酸序列，同時證明蛋白質(zhì)具有明確構(gòu)造，獲得1958年諾貝爾化學(xué)獎；他還建立了快速測定DNA序列的雙去氧終止法（桑格法），于1980年再度獲得諾貝爾化學(xué)獎。在科學(xué)史上，桑格成為繼瑪麗亞 居里、萊納斯 鮑林、約翰 巴丁之后，第四位兩度獲頒諾貝爾獎，且是迄今為止唯一兩次獲得化學(xué)獎的科學(xué)家。他被認(rèn)為是20世紀(jì)世界最偉大的科學(xué)家之一。
桑格和助手塔丕從 1945年開始，就在一間半地下實驗室開始了人們不看好的蛋白質(zhì)氨基酸序列測定的研究，花了10年功夫，在1955年完成了胰島素完整的氨基酸序列測定。在桑格涉足胰島素研究之時，世界生物學(xué)界對于蛋白質(zhì)的認(rèn)知存在較大分歧，一種觀點認(rèn)為，蛋白質(zhì)沒有明確的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)；而另一派則堅持認(rèn)為蛋白質(zhì)具有結(jié)構(gòu)，并且可以通過化學(xué)方法測定氨基酸的排列順序。桑格選擇了分子中只有51個氨基酸的牛胰島素作為樣本，開始了他的研究。
他利用自己發(fā)明的桑格試劑，也就是2,4-二硝基氟苯與胰島素反應(yīng)，使得2.4-二硝基苯基牢固的結(jié)合在胰島素蛋白鏈N-端的氨基上，然后用鹽酸將胰島素徹底水解，進(jìn)行紙層析，根據(jù)不同氨基酸在展開劑中的溶解度和分配系數(shù)的不同分離成一系列斑點，然后再與層析展開的垂直方向進(jìn)行電泳，發(fā)現(xiàn)有兩個黃色氨基酸斑點，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和2,4-二硝基氟苯反應(yīng)產(chǎn)物對比，可以確定它們分別是甘氨酸和苯丙氨酸，這證明胰島素由兩條蛋白鏈組成，每個蛋白鏈的N-端氨基酸分別是甘氨酸和苯丙氨酸。然后分別對兩個蛋白鏈進(jìn)行有限水解，形成大小不同的短的片段，與2,4-二硝基氟苯進(jìn)行反應(yīng)，然后電泳分離和徹底水解，進(jìn)行層析-電泳，確定每個小片段的N-末端氨基酸。掌握蛋白鏈的不同水解條件，將其降解成不同的小片段，再進(jìn)行N-端氨基酸測定，如此可以確定每個片段的氨基酸排列順序。之后，根據(jù)不同片段和交叉片段的氨基酸排列順序，推導(dǎo)出完整的胰島素的氨基酸排列順序。
桑格的研究證明牛胰島素由A、B兩個肽鏈組成,A鏈有21個氨基酸11種，B鏈有30個氨基酸15種，共26種51個氨基酸組成。其中A鏈第7位的半胱氨酸與B鏈第7位的半胱氨酸、A鏈第20位的半胱氨酸與B鏈的第19位半胱氨酸的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來；此外A鏈中第6位半胱氨酸與A鏈第11位半胱氨酸的巰基之間也存在一個二硫鍵。
圖28.牛胰島素的化學(xué)結(jié)構(gòu)
桑格成功地測定了牛胰島素化學(xué)結(jié)構(gòu)，為蛋白質(zhì)的氨基酸序列測定的發(fā)展，及人工合成和改造胰島素奠定了堅實基礎(chǔ)。因此桑格獨享了1958年諾貝爾化學(xué)獎。
圖29.弗雷德里克 桑格（Frederick Sanger，1918-2013）獲得1958年諾貝爾化學(xué)獎（引自網(wǎng)絡(luò)）
圖30.測定氨基酸序列的層析-電泳圖（引自網(wǎng)絡(luò)文獻(xiàn)）
現(xiàn)在看來這項研究就像“1+1=2”那么簡單，可在當(dāng)時，人們只知道蛋白質(zhì)是由19種常見氨基酸組成，但它們是以何種方式構(gòu)成蛋白質(zhì)的卻一無所知。要想搞清楚蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序，沒有那么容易。比如說，一個蛋白質(zhì)只含有19種不同氨基酸，在序列中每種氨基酸只出現(xiàn)一次，19種氨基酸在一條肽鏈上可能就有大約有12億億種排列方式。
這是一個十分費(fèi)力的研究工作，而且很多時候根本得不到準(zhǔn)確的結(jié)果。對于這個并不被世人看好的研究，桑格在那間和別人共用的實驗室里，就挨著關(guān)著小白鼠的籠子旁邊，桑格堅持了10年。桑格還因為使用一種標(biāo)記氨基酸的化學(xué)試劑，影響到共用實驗室的其他人，而遭到投訴，不得不停止使用。
事后回憶這項研究，桑格也覺得“非常艱苦”。但桑格還是覺得這是他“工作過的最美妙的地方”。實驗室對他來說，始終難以割舍。
隨著生物化學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展及高新技術(shù)在生命科學(xué)研究的應(yīng)用，蛋白質(zhì)序列測定技術(shù)發(fā)展非常迅速。開始時手工測定，這種方法既費(fèi)時又浪費(fèi)樣品；1967年研制出蛋白質(zhì)測序儀，從此開始了使用儀器測定蛋白質(zhì)序列的新時代，使得蛋白質(zhì)測序有了迅速發(fā)展。不僅減少了測定周期和樣品使用量，提高了分析精度和準(zhǔn)確性，現(xiàn)在已經(jīng)成為廣泛使用的超微測序技術(shù)。現(xiàn)在一個蛋白質(zhì)樣品只需幾個到十幾個小時，幾微克，甚至幾納克就可以完成。
圖31.桑格與蛋白質(zhì)模型（引自網(wǎng)絡(luò)）
繼氨基酸序列測定完成之后，桑格又開始了另一項研究。1975年，桑格發(fā)明了一種稱為鏈終止法的測定DNA序列方法，這種方法又稱做“雙去氧終止法”或是“桑格法”。兩年之后，他利用此技術(shù)成功地測定了 -X174噬菌體的基因組序列，這也是首次完整的基因組測序工作。他發(fā)明的方法與其他方法相比，使用的材料毒性較低，而受到歡迎。
桑格的DNA雙去氧終止法測序是基于PCR技術(shù)，在核酸模板、核酸聚合酶、引物和四種單脫氧堿基存在條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時，如果在四個試管的反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例加入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長，而鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長。如此每管反應(yīng)體系中便合成以共同引物為5’端，以雙脫氧堿基為3’端的一系列長度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分四個泳道進(jìn)行電泳，以分離僅差一個堿基的長短不一的核酸片段，根據(jù)片段3’端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。
圖32.1980年再次獲得諾貝爾化學(xué)獎的桑格（引自網(wǎng)絡(luò)文獻(xiàn)）
圖33.雙脫氧法測序原理示意圖（引自《中國科學(xué)報》 2013-12-20 第5版人物周刊）
這項研究后來成為人類基因組計劃等得以展開的關(guān)鍵之一，并使桑格于1980年與合作研究的沃特 吉爾伯特以及另一團(tuán)隊的保羅 伯格（Paul Berg）再度獲得諾貝爾化學(xué)獎。1979年，桑格又與吉爾伯特和伯格一同獲得哥倫比亞大學(xué)的路易莎 格羅斯 霍維茨獎。
1983年的一天，桑格在專心做實驗時突然感到自己已經(jīng)老了，于是停下了實驗并宣布自己退休，從此在自己的花園里度過了大部分余生。
桑格及是堅忍不拔的科學(xué)研究斗士，又是個淡泊名利名利的人。桑格和其他科學(xué)家一樣，在科研道路上也并非一帆風(fēng)順。面對失敗，他也有自己的一番感悟和應(yīng)對之道：“我想在大多數(shù)人的研究道路上，都會經(jīng)歷一些失敗的時期。這會讓人覺得郁悶，甚至絕望。對此我找到了最好的解決辦法，就是繼續(xù)向前看。當(dāng)一個實驗完全失敗時，最好不要花太多時間再去擔(dān)心它或者懊惱，而應(yīng)該繼續(xù)規(guī)劃和投入下一個實驗當(dāng)中。新的實驗總會令人興奮，這樣你很快就會忘卻煩惱。”
1986年，桑格獲得英國最高榮譽(yù)“功績勛章”，但拒絕封爵，因為他不喜歡別人稱自己為“爵士”，桑格就是這樣的人。盡管桑格在生物化學(xué)領(lǐng)域成就顯赫，被認(rèn)為是蛋白質(zhì)分子生物學(xué)和基因?qū)W領(lǐng)域的奠基人，但他并未真的蜚聲學(xué)術(shù)界之外，而這也是桑格為人低調(diào)謙遜所致。有報道稱，桑格謙虛到幾乎有點令人難以理解，他稱自己只不過是一個“愛在實驗室胡鬧”的人。還有同事形容桑格實在太低調(diào)了，以至于他被人當(dāng)作實驗室里的清潔工人。所以桑格拒絕接受“爵士”名號也就不以為奇了。
圖34.退休后的桑格（廣州日報？2014年2月22日）
14.早期臨床上使用的胰島素
1923年麥克勞德和班廷將胰島素的專利交于多倫多大學(xué)，很快美國禮來公司獲得生產(chǎn)權(quán)，并于當(dāng)年開始大量生產(chǎn)供應(yīng)臨床應(yīng)用。同樣在歐洲丹麥諾和諾德生物制藥公司的胰島素也很快上市。胰島素使用至今，雖然不能治愈糖尿病，但卻持續(xù)不斷地挽救著無數(shù)人的生命。
時至今日，糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心腦血管疾病之后的第三大殺手，被醫(yī)學(xué)界稱為“萬病之源”，嚴(yán)重威脅著人類的健康。作為糖尿病治療中不可或缺的重點藥物，胰島素自20世紀(jì)60年代開始在我國使用至今，其臨床治療和市場均已逐漸走向成熟。胰島素是最有效的糖尿病治療藥物之一，胰島素制劑在全球糖尿病藥物中的使用量位居第一。對于 型糖尿病患者，胰島素是唯一治療藥物，此外，約有30-40%的 型糖尿病患者最終也需要使用胰島素。
而最初上市臨床使用的胰島素幾乎都是從豬或牛胰臟中提取的。不同動物的胰島素組成均有所差異，豬胰島素與人胰島素的差別很小，只是在B鏈末端差了一個氨基酸，豬胰島素是丙氨酸，而人的胰島素是蘇氨酸。牛胰島素與人胰島素相差三個氨基酸，除了B鏈末端，在A鏈中還相差兩個氨基酸。
圖35.人、豬、牛胰島素的差別（引自網(wǎng)絡(luò)文獻(xiàn)）
豬和牛胰島素雖然價格相對便宜，但是資源有限。就 型糖尿病患者來說，每天必須注射胰島素，如果都從豬的胰腺提取，一個患者一年的藥物需要量，大概需要殺掉70頭豬，我國 型糖尿病患者大約有400-500萬，就按450萬計算，大約需要殺掉3.15億頭豬。這還沒有包括有近30%左右的 型糖尿病患者也需要注射胰島素，現(xiàn)在大約有3千萬 型糖尿病患者。為生產(chǎn)所需的胰島素，需要殺掉的豬量也需翻6-7倍，總需求是20.5億頭豬。在我國，雖然人們習(xí)慣食用豬肉，我國豬肉年消費(fèi)量占到世界的50%以上，大約也就是5700多萬噸，相當(dāng)于大約40萬頭豬，與20.5億頭相比，只是個零頭。為了解決糖尿病治療的豬胰島素的生產(chǎn)問題，還需要飼養(yǎng)更多更多的豬。而豬肉市場需求有限，銷售不了的豬肉成為負(fù)擔(dān)，直接影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。為了飼養(yǎng)這些豬，需要消耗大量的飼料、糧食，產(chǎn)生大量豬糞便需要處理，這樣會帶來嚴(yán)重的資源和環(huán)境問題。
豬或牛胰島素都不是人體的蛋白質(zhì)，長期使用會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，在人體內(nèi)會產(chǎn)生抗體，與胰島素結(jié)合形成抗體-抗原復(fù)合物，造成胰島素治療效果下降，少數(shù)患者免疫反應(yīng)較嚴(yán)重，可出現(xiàn)皮疹、發(fā)燒，全身發(fā)癢，甚至血壓下降、休克等問題。
在胰島素的化學(xué)結(jié)構(gòu)上，豬胰島素比牛胰島素更接近人胰島素，在相對的治療效果和副反應(yīng)上豬胰島素也比牛胰島素好些，所以我國在臨床上用于糖尿病治療的主要是豬胰島素。但是長期使用就會出現(xiàn)免疫反應(yīng)、療效下降的問題。
15.豬胰島素的改造
為了解決這些問題，上個世紀(jì)70年代初,美國加利福尼亞大學(xué)的生物化學(xué)家盧登堡利用化學(xué)方法成功地將豬胰島素改造成為人胰島素。這一方法一共有五步，首先用胰蛋白酶將豬胰島素分子中的B鏈上最后8個氨基酸脫去，然后在脫去這些氨基酸的部位,再連接上人工合成的相當(dāng)于人胰島素B鏈最后8個氮基酸的化合物，這樣就可以得到在分子結(jié)構(gòu)上與人胰島素一樣的胰島素。這個方法最初因生產(chǎn)成本過高，無法應(yīng)用，后來經(jīng)改進(jìn),可以在一個反應(yīng)器中進(jìn)行生產(chǎn),成本降低至僅為豬胰島素的2-3倍，將豬胰島素改造成為人胰島素才已獲成功。
后來，人們發(fā)現(xiàn)在pH為6-7的有機(jī)相中使用胰蛋白酶催化，在過量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，可以將豬胰島素B鏈C末端的丙氨酸替換下來，形成的人胰島素叔丁酯再用三氯乙酸脫去叔丁酯基團(tuán)，最終獲得人胰島素，該過程的總轉(zhuǎn)化率為60%。這種方法使得豬胰島素改造成為人胰島素更加簡便，生產(chǎn)成本更加低廉，使得豬胰島素改造成人胰島素在臨床上治療糖尿病成為現(xiàn)實。
圖36.豬胰島素改造成為人胰島素的示意圖