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18.臨床上使用的胰島素
在臨床上使用的胰島素根據(jù)來源和化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，可以分為三大類或三代產(chǎn)品：第一代是動物源性胰島素，主要從豬和牛等動物胰臟提取而來，在1923年禮來生產(chǎn)的世界上第一支商品化產(chǎn)品因蘇林就是動物胰島素。動物源性胰島素存在異源性過敏反應(yīng)問題，目前已經(jīng)逐漸淘汰，國際市場的占有率只有2%不到。我國應(yīng)用卻還很普遍，動物源性胰島素還入選了我國2009年版的國家基本藥物目錄。長期使用動物胰島素會產(chǎn)生免疫反應(yīng)，胰島素耐藥，反復(fù)出現(xiàn)的高血糖、低血糖，注射部位脂肪萎縮，水腫（水鈉潴留）等問題。
第二代是基因重組人胰島素，主要利用大腸桿菌或酵母表達人胰島素。商業(yè)化的基因重組人胰島素首先由禮來公司于1982年推出，基因重組人胰島素在國際和國內(nèi)市場的集中度都很高，占據(jù)了全球90%以上的市場份額。國內(nèi)市場主要被國際上大的胰島素生產(chǎn)公司占據(jù)。2006年，我國胰島素銷售額為23億元，國際上大的胰島素生產(chǎn)公司產(chǎn)品占據(jù)市場95.6%。與動物源胰島素不同，基因重組人胰島素國內(nèi)企業(yè)較少，而國內(nèi)企業(yè)加起來總共不到5%的市場份額?；蛑亟M人胰島素起效慢，存在高血糖和低血糖問題。
第三代是人胰島素類似物，通過對人的胰島素基因進行改造獲得。胰島素類似物起效更快，作用更持久，副作用更小。胰島素類似物控制血糖的效果與人胰島素類似，在模擬生理性胰島素的分泌以及減少低血糖的方式方面更具優(yōu)勢。目前，此類胰島素在國內(nèi)應(yīng)用少，市場還很小，國內(nèi)只有一家公司具有胰島素類似物的研制能力。
在臨床上使用的胰島素可根據(jù)作用特點分為超短效胰島素類似物、短效胰島素、中效胰島素、長效胰島素、長效胰島素類似物、預(yù)混胰島素和預(yù)混胰島素類似物等。
目前在我國市場上的胰島素制劑從技術(shù)水平上可以分為低端的動物胰島素（即一代胰島素）、中端也是用量最大的基因重組人胰島素（即二代胰島素）、高端的胰島素類似物（又稱三代胰島素）等三大類。其中動物胰島素曾經(jīng)因為價格低廉占據(jù)過一定的市場份額，但現(xiàn)在市場份額幾乎可以忽略不計了，而高端的胰島素類似物因其本身的優(yōu)異特性，更接近人體生理，更少引起低血糖等因素而發(fā)展迅猛。從圖40？可以看到臨床使用的胰島素的發(fā)展情況。
19.用細菌生產(chǎn)人胰島素
將豬胰島素改造成為人胰島素，并在臨床上應(yīng)用成功。發(fā)現(xiàn)用人胰島素治療糖尿病時，一般不會產(chǎn)生抗原反應(yīng)，因此療效高；因為人胰島素就是人體蛋白，極少產(chǎn)生藥物過敏反應(yīng)，或皮下脂肪萎縮。與動物胰島素相比免疫性胰島素抵抗發(fā)生率顯著下降，用藥劑量也顯著減少；而且人胰島素吸收快、作用快、藥效集中。但是以豬胰島素為原料再加工成人胰島素，生產(chǎn)成本大幅度提高，會造成大量臨床應(yīng)用困難。而且將豬胰島素改造成人胰島素需要養(yǎng)更多的豬，資源有限。用豬胰島素改造為人胰島素的成本更高，患者的治療費用就會翻倍。這些成為將豬胰島素改造成人胰島素的瓶頸。
隨著生命科學(xué)的不斷進步和生物技術(shù)，特別是基因重組、基因工程的發(fā)展，使得開發(fā)新的人胰島素生產(chǎn)方法成為可能。
最初，人們了解這些以后設(shè)想將胰島素基因如果轉(zhuǎn)到細菌，比如大腸桿菌中來生產(chǎn)人胰島素。但是由于大腸桿菌不具備胰島 細胞的加工、轉(zhuǎn)運能力；而且大腸桿菌對基因的偏好性與人的細胞對基因的偏好性不同，將人的胰島素基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中，基因轉(zhuǎn)錄和翻譯效率就會大大降低。另外，由于人們掌握了人胰島素的氨基酸組成和基因轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)的“三聯(lián)密碼子”原則后，科學(xué)家們就考慮可以根據(jù)人胰島素的氨基酸排列順序，和大腸桿菌對基因的脫氧核糖核酸偏好性，分別人工合成胰島素A和B鏈的基因，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，分別表達，然后分離純化后在經(jīng)過化學(xué)加工，合成人胰島素。
根據(jù)這樣的設(shè)想，進行了大量的研究，建立了胰島素的AB鏈合成法。將人工合成的人胰島素A鏈和B鏈基因分別與半乳糖苷酶基因連接，形成融和基因，再分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌中構(gòu)建能夠分別表達A鏈和B鏈基因與半乳糖苷酶基因工程菌。
分別構(gòu)建的A和B鏈基因的兩種基因工程菌，經(jīng)分別培養(yǎng)，獲得大量工程菌菌體細胞，然后將細胞破碎，釋放出表達的A鏈及B鏈與半乳糖苷酶結(jié)合的融合體。但是因為大腸桿菌屬于原核菌，蛋白質(zhì)合成功能有限，基因表達的蛋白質(zhì)大多數(shù)是沒有活性的，不溶于水的包含體。需要使用尿素溶液使之溶解，然后用透析的方法將尿素逐漸除去，使蛋白質(zhì)分子鏈重新排布，使之具有正確結(jié)構(gòu)和活性，這稱為“變性和復(fù)性“。經(jīng)過分離純化，獲得純凈的與半乳糖苷酶結(jié)合在一起的A鏈及B鏈融合蛋白。再經(jīng)過化學(xué)處理除掉半乳糖苷酶，獲得A鏈及B鏈，利用化學(xué)氧化作用，通過二硫鍵將A鏈和B鏈連接起來，合成完整的有活性的人胰島素。
這樣的生產(chǎn)工藝過程和條件過于復(fù)雜，由于A鏈和B上共存在六個半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對率較低，通常只有10%-20%，因此采用這條工藝路線生產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達100美元以上。為了進一步降低生產(chǎn)成本，隨后又開發(fā)了新的利用基因工程菌生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線。
為了采用完整的人胰島素基因構(gòu)建基因工程菌，首先需要獲得完整的人胰島素基因。將胰島 細胞分離、破碎，從中提取總核糖核酸（RNA）。由于帶有基因密碼信息的信使RNA（mRNA）帶有人胰島素的全部信息。需要從總RNA中將我們需要的人胰島素mRNA分離出來。好在在mRNA的一端有一段特別的結(jié)構(gòu)，能夠特異吸附在寡脫氧胸腺苷酸通過5′-磷酸與纖維素共價結(jié)合的一種層析介質(zhì)上。使用它可以將一端帶有一段特別的結(jié)構(gòu)mRNA與其他mRNA分離出來。但是還不是純凈的人胰島素mRNA，其中還可能存在其他蛋白質(zhì)的mRNA，還需要進一步的分離。
由于人胰島素基因的DNA序列已經(jīng)知道，可以設(shè)計一個“引物”，實際上就是按著人胰島素基因兩端的脫氧核糖核酸的排列順序人工合成的大約有十幾個脫氧核糖核酸的兩個DNA片段。它們可以分別與mRNA相應(yīng)配對的一端結(jié)合，然后在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下，按著mRNA的核糖核酸的排列順序合成出與之匹配的DNA，稱為cDNA。然后就可以利用DNA聚合酶催化，以cDNA為模板大量合成人胰島素基因。這樣獲得的基因是完整的人前胰島素原的基因。然后將其轉(zhuǎn)到大腸桿菌構(gòu)建基因工程菌，經(jīng)大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)人胰島素。
利用這種方法生產(chǎn)人胰島素要比以前的A、B鏈分別生產(chǎn)然后再拼接的方法來的簡便，成本較低，規(guī)?？梢愿?。但是，由于大腸桿菌表達的人胰島素依然以包含體形式存在，需要復(fù)雜的變性復(fù)性處理，而且收率不高，后面的處理純化也十分復(fù)雜，促使人們尋找更好的方法。
之后人們又將A鏈和B鏈基因融合在一起，再與 半乳糖苷酶基因融合轉(zhuǎn)入大腸桿菌，構(gòu)建一種新的A鏈和B鏈同時表達方法。但因為表達后依然需要將包含體變性復(fù)性，去除 半乳糖苷酶，然后將連在一起的A鏈和B鏈裂解開，再進行組合折疊，獲得有活性的人胰島素。這一新的方法后處理也十分復(fù)雜。
后來發(fā)現(xiàn)將胰島素基因原基因與 內(nèi)酰胺酶基因融合注入大腸桿菌，可以使表達的融合蛋白分泌到細胞外，而不是包含體，因此使得后面的分離純化和加工簡單化，使得人胰島素的生產(chǎn)又前進了一大步。
隨著基因重組技術(shù)和表達宿主的擴寬，不斷探索其他可以利用的宿主菌，發(fā)現(xiàn)酵母菌，作為真核生物，在基因表達和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯、加工、運輸?shù)榷鄠€方面都優(yōu)于大腸桿菌。可以將翻譯的蛋白質(zhì)分泌到細胞外，具有正確的天然結(jié)構(gòu)，使得產(chǎn)物的分離純化工藝大大簡化，進步可以降低生產(chǎn)成本。
因此科學(xué)家將通過胰島 細胞獲得的前胰島素原基因克隆到酵母菌細胞中，發(fā)現(xiàn)利用酵母菌表達，在許多方面優(yōu)于大腸桿菌。使得人胰島素的生產(chǎn)過程大大簡化。
首先酵母菌表達的是能夠分泌到細胞外的可溶性胰島素原，而不是沒有活性的不可溶的包含體。因此工程菌大規(guī)模培養(yǎng)后，胰島素原溶解在培養(yǎng)液中，只需離心除去菌體，不需要破碎細胞，更不需要變性復(fù)性。經(jīng)過比較簡單的超濾濃縮，除去部分小分子雜質(zhì)，然后進行離子交換色譜，直接將胰島素原分離純化。然后加入沉淀剤使之沉淀，離心獲得純化的胰島素原。利用胰蛋白酶和羧肽酶處理，脫去C肽，經(jīng)過進一步的純化、結(jié)晶，即可獲得合格的人胰島素產(chǎn)品。
利用構(gòu)建的酵母基因工程菌生產(chǎn)人胰島素顯然比利用大腸桿菌基因工程菌生產(chǎn)人胰島素具有更大優(yōu)勢。
自1982年，美國禮來公司（Ely LiLi）首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，成為世界上第一個上市的基因工程藥物。1987年，諾和諾德（Novo？nordisk）公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。這兩個企業(yè)每年生產(chǎn)十幾噸的人胰島素，幾乎可以滿足世界糖尿病患者對胰島素的市場需求。
20.人胰島素的“進化”
人體分泌的胰島素是“快進快出”，進餐后血糖開始升高，胰腺受到刺激立刻大量分泌胰島素進入血液，很快達到峰值。然后分泌又迅速減少，恢復(fù)到基礎(chǔ)胰島素水平。餐后因消化產(chǎn)生的大量葡萄糖進入肝臟，在胰島素的控制下迅速轉(zhuǎn)化為糖原，儲存起來，使得血液中的葡萄糖濃度很快降到正常水平。
而皮下注射人胰島素不能直接進入血液，因為胰島素會聚合，形成六聚體、四聚體、二聚體和單體，不管是餐前還是餐后注射，經(jīng)過充分稀釋，聚合體經(jīng)過解聚，形成二聚體或單體胰島素，才能通過毛細血管壁進入血液，這樣就造成吸收延滯期。這個延遲使得人胰島素達到峰值和恢復(fù)到基礎(chǔ)水平的時間都有延長。因此人胰島素必須在餐前提前30分鐘注射，才能與進餐后的血糖高峰時間同步。
A單體  B二聚體  C六聚體
為了解決上述問題，科學(xué)家首先利用X-射線衍射研究了人胰島素的分子空間構(gòu)型和形成聚合體的原因。在適當pH條件下，不同胰島素分子的肽鏈之間可以形成氫鍵，特別是在鋅離子存在下，胰島素分子之間發(fā)生集聚，可以形成由二到六個胰島素分子構(gòu)成的不同聚合體。作為藥物使用的人胰島素制劑主要以六聚體形式存在，進入人體后胰島素聚合體要逐漸解離，在人體內(nèi)真正發(fā)揮作用的是單分子的胰島素。
20世紀90年代末，科學(xué)家們根據(jù)人胰島素的氨基酸排列順序和形成聚合體的原因，對人胰島素進行“小手術(shù)”。主要是根據(jù)組成人胰島素的51個氨基酸中關(guān)鍵的氨基酸對空間構(gòu)型、聚合作用及藥效的影響，找到可以改造或可替換的氨基酸。對人胰島素的“小手術(shù)”，就是根據(jù)每個氨基酸都是由基因上對應(yīng)的三個脫氧核糖核酸的“三聯(lián)密碼子”決定的原則，通過將有利于人胰島素分子間形成氫鍵的氨基酸進行更換，從而改變?nèi)艘葝u素分子之間的相互作用，減少形成聚合體的能力，而研發(fā)出具有超短效、短效和長效人胰島素類似物。
這種對人胰島素基因中關(guān)鍵的脫氧核糖核酸進行改變，也就是對基因?qū)嵭懈脑欤谏锛夹g(shù)里稱為“蛋白質(zhì)工程”。利用這種方法構(gòu)建基因工程菌合成的重組人胰島素與胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細胞和成纖維細胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動力學(xué)等指標上均與天然胰島素沒有任何區(qū)別，而且還具有無免疫原性、注射吸收迅速等優(yōu)點，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。
人胰島素類似物改變了人胰島素的缺陷，更好地模仿人體內(nèi)胰島素的特點，更加符合人體的生理需求。科學(xué)家又將速效和中效胰島素按一定比例預(yù)混，制作出預(yù)混胰島素類似物。這類胰島素的特點是兼顧了短效和長效人胰島素類似物的優(yōu)點，可以兼顧空腹血糖和餐后血糖，而且更安全，減少低血糖的發(fā)生，也不需要餐前30分鐘注射，臨餐注射即可，更為便利。
超短效胰島素，起效時間為15分鐘，作用高峰30～45分鐘，持續(xù)時間約2～4小時，主要有天門冬氨酸胰島素和賴脯胰島素。這兩個都是人胰島素類似物，是通過將人胰島素的肽鏈上的氨基酸進行移位、替代、重組等進行新的排列，來改變胰島素作用時間。賴輔胰島素是在人胰島素B28位脯氨酸由帶負電荷的賴氨酸取代而形成；而門冬胰島素則是由人胰島素B28位脯氨酸由天門冬氨酸代替形成。之所以它們能在短時間內(nèi)迅速發(fā)揮降糖作用就是因為這些結(jié)構(gòu)的改變使電荷排斥，阻隔了胰島素單體間的自我聚合。在溶液中胰島素主要以單體和雙體的混合物形式存在，而單體就是胰島素作用的結(jié)構(gòu)，所以其作用時間就快了。
中效胰島素主要是低精蛋白鋅胰島素，主要包括低精蛋白鋅胰島素和胰島素鋅混懸液，起效時間為1.5～4小時，作用高峰4～12小時，持續(xù)時間約14～20小時。市場上常用的有低精蛋白重組人胰島素注射液（甘舒霖N）；中性低精蛋白鋅人胰島素（諾和靈N）；精蛋白鋅重組人胰島素注射液（優(yōu)泌林N）等。中效胰島素的結(jié)構(gòu)是通過魚精蛋白將幾個六聚體聚集在一起，從而解離為單體的時間需要更長，這樣就能延長胰島素的作用時間。這類胰島素需每天定時分一次或二次注射。
長效胰島素主要有甘精胰島素和地特胰島素，這兩例胰島素都屬于人胰島素類似物。其中甘精胰島素是將人胰島素B31-B32-增加了2個精氨酸，A21位由甘氨酸替代天門冬氨酸，通過改變氨基酸的排列使胰島素的等電點發(fā)生改變，從原來的pH5.14變?yōu)?.17，人體pH值是7.14，這樣當它注入到人體內(nèi)，由于等電點不同，進入人體后就會發(fā)生沉淀，同時，因為制劑中存在鋅離子，能增加胰島素六聚體的穩(wěn)定性，六聚體分解的時間也延長，造成吸收延遲且延長，釋放緩慢平穩(wěn)，幾乎沒有峰值。
地特胰島素也是通過氨基酸的改變成為中性可溶性液體，以六聚體形式存在，皮下注射后其吸收擴散速度緩慢，在血漿中98%~99%與白蛋白結(jié)合，以極其緩慢速度釋放入血，藥物的半衰期顯著延長，約為14小時，血漿濃度平穩(wěn)，峰谷曲線小。此類胰島素一般每日定時注射一次，作為補充基礎(chǔ)胰島素。
預(yù)混胰島素,是將短效胰島素和中效胰島素按不同比例進行混合，使得同時具備短效和長效作用的胰島素。?？吹綆?shù)字的的胰島素（如30R、50R等），其中的數(shù)字代表的就是短效或超短效胰島素成分所占的比例。即使是預(yù)混型的胰島素，也要知道，人胰島素是需要餐前15-30分鐘注射；而人胰島素類似物則不然，注射后無需等待，可以馬上進食。但是，由于在人體內(nèi)代謝速度比較快，半壽期較短，故單獨使用時有可能作用高峰期出現(xiàn)低血糖或清晨高血糖。
由于不同胰島素和他們的混合制劑具有不同的特性，大夫會根據(jù)病人的病情進行調(diào)整，選擇適合的胰島素制劑進行治療。